Portal informacyjny
Nauki ścisłe
Laser w służbie zdrowia
Nad nowymi rozwiązaniami technologicznymi dla produktów mleczarskich oraz metodami identyfikacji lipidów i wykrywania biomarkerów nowotworowych pracują naukowcy w Interdyscyplinarnym Centrum Nowoczesnych Technologii UMK wykorzystujący techniki LDI.
Badacze zajmują się zastosowaniem technik laserowej jonizacji/desorpcji (LDI). Jest to proces powodujący naładowanie cząstek wywołany laserem najczęściej o długości fali z zakresu UV. Metody te, wykorzystujące proces transferu energii weszły do laboratoriów w drugiej połowie lat 60. ubiegłego wieku. Są szczególnie atrakcyjne ze względu na dużą czułość oznaczeń, tolerancję na zanieczyszczenia oraz niewielką ilość próbki potrzebną do przeprowadzenia analiz, co w przypadku cennego materiału ogranicza jego straty. Techniki LDI należące do tzw. metod miękkiej jonizacji mogą wymagać matrycy, najczęściej słabego kwasu, tworzącego kryształy, umożliwiającego proces (MALDI) lub nie. Naukowcy z ICNT zajmują się głównie MALDI oraz syntezą uniwersalnych płytek LDI, w których jonizacja jest wspomagana nanostrukturami (płytki NALDI).
fot. Andrzej Romański
Są to techniki pozwalające m.in. sekwencjonować białka, poznawać modyfikacje potranslacyjne, identyfikować lipidy i szukać biomarkerów nowotworowych. – Charakteryzujemy też białka pod kątem wykorzystania ich w nowych układach wykazujących właściwości antyseptyczne, np. do gojenia trudnych ran albo jako dodatki do produktów spożywczych – mówi dr hab. Paweł Pomastowski, prof. UMK z Interdyscyplinarnego Centrum Nowoczesnych Technologii. – W 2018 r. powołaliśmy BioServ sp. z o.o., spółkę spin-off Uniwersytetu Mikołaja Kopernika zajmującą się badaniem dla przemysłu tego, co opracowujemy w laboratorium. Obecnie pracujemy m.in. nad nowymi rozwiązaniami technologicznymi dla produktów mleczarskich, metodami produkcji lepszego masła, serka, napoju serwatkowego.
Supermasło
Jeśli badania naukowców zakończą się sukcesem, zakłady mleczarskie będą mogły produkować np. masło z witaminą D3 i mikroelementami, np. cynkiem. Masło będzie naturalne, bez żadnych sztucznych dodatków.
Gdy wychodzimy na zewnątrz, pod wpływem światła nasza wątroba zaczyna produkować witaminę D3 – tłumaczy prof. Pomastowski. – W przemyśle, zamiast słońca, wykorzystuje się promieniowanie UV, naświetlając śmietanę lampami albo dodaje się do masła oleje roślinne lub rybne, które są bogate w witaminę D3 (jednak walory smakowe są nie najlepiej ocenienie przez konsumentów). A przecież w maśle jest cholekalcyferol, prekursor witaminy D3, a ten przekształca się w witaminę D3. Rodzi się więc pytanie, w jaki inny sposób cholekalcyferol przekształcić w witaminę D3? I między innymi nad tym pracujemy.
Dzięki promieniowaniu UV powstaje witamina D3, ale nie jest ono obojętne dla naszego organizmu, bo przy okazji tworzą się rodniki. Dlatego naukowcy pracują nad tym, jak wyeliminować naświetlanie śmietany z produkcji masła. Zauważyli, co było szeroko opisywane w światowej literaturze fachowej, że w jelitach cieląt karmionych serwatką bogatą w laktoferynę, nazywaną białkiem XXI w., zaobserwowano dwukrotnie lub trzykrotnie, a u krów holsztyńskich nawet wielokrotnie wyższe stężenie witaminy D3 niż w innych miejscach ciała. Toruńscy chemicy doszli do wniosku, że przyczyną podwyższonego stężenia są bakterie probiotyczne.
Wykorzystując techniki LDI, zaczęli je izolować i deponować. Mają już swoje depozyty patentowe. Dowodzą, że obecność bakterii będzie miała dwa aspekty. Są one potrzebne w mleku do fermentacji, czyli jego ukwaszania. Chemicznie ukwasza się mleko, wykorzystując syntetyczny kwas mlekowy. - My będziemy robić to naturalnie, tak jak robiły to nasze babcie, odstawiając mleko, żeby zsiadło – informuje prof. Pomastowski. - Ukwaszanie jest możliwie dzięki przejściu laktozy w kwas mlekowy. Dodatkowo bakterie, z którymi pracujemy, zmieniają profil kwasów tłuszczowych, co obecnie bada dr Magdalena Buszewska-Forajta z Instytutu Medycyny Weterynaryjnej. Okazuje się bowiem, że dzięki tym bakteriom złych kwasów jest mniej, bo mikroorganizmy je "zjadają", wykorzystując do swoich procesów, a przy okazji powstają kwasy nienasycone, czyli te zdrowe, Omega, ochronne dla naszego serca. Prawdopodobnie produkcja kwasów wpływa na syntezę i konwersję 3-hydroxycholesterolu do witaminy D3. Badamy teraz ten mechanizm, chcemy uzasadnić go molekularnie.
Toruńscy naukowcy pracują też nad rozwiązaniami technologicznymi pozwalającymi na produkcję tzw. szampanów serwatkowych, wzbogacanych witaminami B. Przyznają, że jest to prostsze zadanie, ponieważ witamina B jest produkowana przez niektóre szczepy bakterii probiotycznych. Chcieliby też wypracować rozwiązania eliminujące alergeny z mleka. – Niektórzy ludzie nie mogą jeść produktów mlecznych z różnych względów – wyjaśnia prof. Pomastowski. - Nie trawią laktozy albo mają skazę białkową, która obejmuje uczulenie na beta-laktoglobulinę, beta-kazeinę w wariancie genetycznym A1, kappa-kazeinę. My się specjalizujemy w kazeinach. Było to tematem mojej pracy doktorskiej i habilitacji.
Bakterie na tacy
Produkcja spożywcza to niejedyna dziedzina, w której wykorzystuje się techniki LDI. Jest już kilka ośrodków w Polsce wykorzystujących MALDI w diagnostyce mikrobiologicznej. Są gotowe certyfikaty IVD, które umożliwiają identyfikację mikroorganizmów do celów klinicznych. Najbliższym ośrodkiem, z którym współpracują chemicy z UMK, jest szpital w Grudziądzu. Tam MALDI wykorzystywane jest do identyfikacji mikroorganizmów u osób z trudno gojącymi się ranami, z wrzodami, stopami cukrzycowymi. Mikroorganizmami zajmuje się dr Michał Złoch z ICNT. Powstało już szereg prac z zakresu wykorzystania technik MALDI i NALDI w identyfikacji gronkowców.
Naukowcy opracowują metodę identyfikacji mikroorganizmów, których normalnymi technikami nie da się oznaczyć albo otrzymuje się słabe wyniki. Poza tym dr Złoch razem z dr. Markusem Kostrzewą pracują nad komercyjnym testem umożliwiającym badanie lekooporności, który będzie wdrażany w szpitalach niemieckich. Dzięki temu medycy będą wiedzieć nie tylko, z jaką bakterią mają do czynienia, ale taż na jakie leki jest odporna. To już jest medycyna XXI w.
Wraz z dr hab. Dorotą Gabryś z Narodowego Centrum Onkologii w Gliwicach realizujemy projekt Opus, w którym będziemy wykorzystywać techniki LDI do identyfikacji mikrobiomu u osób z nowotworem układu moczowo-płciowego poddanych radioterapii – mówi prof. Pomastowski. - Okazuje się, że radioterapia nie tylko powoduje, że źle się czujemy, ale także wpływa na nasz mikrobiom. Chcemy poznać ten mechanizm.
Jeżeli chodzi o farmaceutykę, techniki rozwijane przez toruńskich naukowców szczególnie sprawdzają się w kontekście produkcji preparatów na bazie mikroorganizmów. - Potencjał aplikacyjny jest duży, czego dowodem są granty, które dostajemy na MALDI – mówi prof. Pomastowski. - Jeden z projektów kierowany przez prof. dr. hab. Bogusława Buszewskiego z Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki dotyczy wykorzystania techniki MALDI do opracowywania metod identyfikacji mikroorganizmów niższych niż bakterie, czyli wirusów. Chcemy opracować metodę będącą konkurencją dla PCR (Polymerase Chain Reaction - badanie genetyczne powszechnie stosowane w diagnostyce wielu chorób, polegające na wielokrotnym powielaniu specyficznego fragmentu DNA za pomocą enzymu polimerazy). Może mieć to duże znaczenie, szczególnie w przypadkach pandemicznych.
Walka z rakiem i dopalaczami
Z kolei dr Buszewska-Forajta w swoim projekcie poszukuje markerów raka prostaty w moczu, krwi i tkance. MALDI może być również wykorzystywane do tzw. bezpośredniej analizy np. antybiotyków w moczu, antybiotyków we krwi. Nie trzeba niczego wyodrębniać, wystarczy tylko wziąć kroplę moczu i za chwilę mamy wynik. Grupy z Niemiec wykorzystują już MALDI do analiz śladowych pozostałości po dopalaczach i narkotykach.
Podsumowując, LDI wykorzystujemy do analizy wszystkiego, co da się zjonizować, co jest warunkiem powstania m.in. niskocząsteczkowych leków, antybiotyków, związków, takich jak roślinne cyklitole – tłumaczy prof. Pomastowski. – Badamy lipidy z jaja kurzego, z mleka, z moczu, jako markery nowotworowe. Dr hab. Katarzyna Rafińska z Katedry Chemii Środowiska i Bioanalityki zajmuje się hodowlą roślin wspomaganych nanocząsteczkami, przez co są bardziej odporne na infekcje bakteryjne albo na suszę. I rodzi się pytanie, dlaczego tak się dzieje? Może dlatego, że produkują białka wiążące wodę, dające odporność. Jeśli tak, to jakie to białka?
Obecnie w laboratoriach diagnostycznych do identyfikacji mikroorganizmów stosuje się głównie konwencjonalne techniki opierające się na testach biochemicznych, które są czaso- i pracochłonne oraz często są nieodpowiednie do rozróżnienia gatunków podobnych fenotypowo. Jednakże szybki rozwój biologii molekularnej umożliwił zastosowanie bardziej precyzyjnego narzędzia diagnostycznego, jakim jest zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a następnie sekwencjonowanie fragmentu genu 16S rRNA. Obecnie technika sekwencjonowania 16S rRNA jest uważana za "złoty standard" w identyfikacji mikroorganizmów. Metody biologii molekularnej charakteryzują się wysoką czułością, dokładnością, mocą dyskryminacyjną i odtwarzalnością. Jednak oprócz licznych zalet ich zastosowanie wiąże się również z licznymi ograniczeniami. Głównym problemem jest długi czas potrzebny do uzyskania wiarygodnego wyniku - do 3 dni. Ponadto koszty analizy są uznawane za bardzo wysokie, co znacząco ogranicza wykorzystanie tej technologii w rutynowej diagnostyce. Alternatywą dla czułych technik biologii molekularnej jest technika spektrometrii mas z użyciem laserowej desorpcji/jonizacji (LDI) z analizatorem czasu przelotu (TOF), która jest stosunkowo nową, ale bardzo obiecującą metodą identyfikacji mikroorganizmów.
Szacuje się, że identyfikacja za pomocą techniki LDI w wariancie wspomaganym matrycą (MALDI) może obniżyć koszty analizy o ponad 50 proc. rocznie w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
Techniki LDI mają jednak podstawową wadę – sprzęt niezbędny do ich realizacji jest horrendalnie drogi. Ale jednostkowa analiza, gdy naukowcy zaczynają działać rutynowo, już się opłaca. Istnieją prace Amerykanów, które pokazują, że np. koszt PCR waha się od 5 do 15 dolarów w zależności od zakresu, a analiza MALDI zaczyna się już od 1 dolara, ponieważ koszty przygotowania materiału, potrzebnych reagentów i nakładu pracy są znacznie mniejsze.
Za i przeciw
Główne zalety tej technologii to szybkość i prostota analizy, a także dokładność uzyskanych wyników. Identyfikacja bakterii za pomocą MALDI-TOF MS zrewolucjonizowała świat diagnostyki mikrobiologicznej, oferując identyfikację gatunków w ciągu kilku minut z dokładnością, która odpowiada, a często przewyższa konwencjonalne systemy identyfikacji. Niestety metoda ta ma również wiele ograniczeń. Jednym z największych problemów jest wciąż niewystarczająca liczba widm zdeponowanych w komercyjnych bazach danych, które są wykorzystywane w laboratoriach posługujących się tą metodą. Inną wadą jest to, że w celu uzyskania widma dobrej jakości konieczne jest zdobycie czystych kultur mikroorganizmów o stosunkowo wysokiej liczbie komórek w próbce, co przedłuża czas potrzebny do uzyskania wyniku o konieczność przeprowadzenia etapu hodowli. Ponadto skład pożywki hodowlanej i rodzaj matrycy zastosowanej podczas analizy może również istotnie wpływać na wydajność identyfikacji. Podobnie jak w przypadku metod biologii molekularnej, MALDI może nie być w stanie właściwie rozróżnić widm niektórych blisko spokrewnionych gatunków bakterii, co prowadzi do braku lub błędnej identyfikacji. Obecnie na rynku polskim brakuje laboratoriów, które oferowałyby rozwiązania tych problemów, które jednocześnie byłyby konkurencyjne w stosunku do innych metod. Nad rozwiązaniem tego typu problemów naukowcy z ICNT pracują w ramach projektu Tango V, finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju.
Ze względu na zbyt wysokie dla małych laboratoriów ceny urządzeń na razie techniki LDI nie są wykorzystywane w badaniach bakterii środowiskowych przy kontrolach wód i gleb.
Wadą MALDI jest też wysoki poziom skomplikowania danych. W trakcie jednej analizy zbiera się setki różnych widm, a w formie matematycznej są to dziesiątki, jeśli nie setki tysięcy danych jednego powtórzenia, a badacze robią takich powtórzeń tysiące. Potrzebna jest więc ogromna moc obliczeniowa, żeby wyciągnąć wnioski.
Poza tym MALDI daje odpowiedź na pytanie, co konkretnie w naszej próbce się znajduję, czy to czego szukamy w niej występuje, czy nie. Nie jest natomiast techniką pozwalającą określić, ile mamy czegoś w próbce, nie służy do analiz ilościowych. W przypadku białek badania mogą być jedynie półilościowe. Jeżeli chodzi o wirusy, można powiedzieć, że w próbce jest ich tyle, żeby przekroczyć granicę detekcji, czyli więcej niż, ale nie konkretnie ile. - Przeciwciała to są białka, więc będziemy wiedzieli orientacyjnie, ile ich jest i do tego służy technologia SELDI – tłumaczy prof. Pomastowski. - Można w cudzysłowie powiedzieć, dodajemy znaną ilość związku, który się przyłącza do białka i w wyniku strzału następuje jego rozpad i my po sygnale jesteśmy w stanie wskazać, ile konkretnie tego związku jest i aproksymować to do stężenia białka. Stąd mówi się, że są to analizy półilościowe. Aktualnie w ramach Projektów Preludium, Opus czy Tango pracujemy wraz z dr. hab. Piotrem Piszczkiem, prof. UMK oraz dr hab. Aleksandrą Radtke, prof. UMK z Katedry Chemii Nieorganicznej i Koordynacyjnej, dr Gulyaim Sagandykovą oraz dr. inż. Adrianem Arendowskim z ICNT nad wykorzystaniem płytek NALDI do analiz ilościowych związków niskocząsteczkowych.
Tematyką technik LDI w Interdyscyplinarnym Centrum Nowoczesnych Technologii zajmuje się od 10 do 12 osób.
