Natural sciences [2020-10-27]

Od malowania kwiatów do produkcji odporniejszych roślin

— Marcin Behrendt

O wadach i zaletach metody "nożyc molekularnych" (CRISPR), za którą Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna dostały w tym roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii, oraz o produkcji roślin o zmodyfikowanym genomie opowiada dr Agnieszka Mierek-Adamska z Wydziału Nauk Biologicznych i Weterynaryjnych UMK.

Metoda "nożyc molekularnych" (CRISPR), opracowana przez noblistki, daje możliwość wycinania, modyfikowania, czy wymieniania konkretnego fragmentu DNA w żywych komórkach. To system naturalnie występujący u bakterii, mających potrzebę obrony przed obcym DNA np. przed wirusami.

Wirusy mają materiał genetyczny i otaczający go płaszcz białkowy, czyli kapsyd. Potrafią się rozmnażać, a - doprecyzowując - potrafią się namnażać, a właściwie powielać. Ale nie sam. Potrzebuje odpowiedniej dla danego wirusa komórki gospodarza. Wirus swój materiał genetyczny wkleja w materiał genetyczny komórki, a ta powielając swój materiał genetyczny powiela też jego. I potem ten fragment DNA wirusa pakuje się znowu w kapsyd, dochodzi do zniszczenia komórki gospodarza i tak powielają się kolejne komórki, a wirus się rozprzestrzenia. Dlatego bakterie przechowują w swoim genomie fragmenty wirusowego DNA. Kiedy wirus próbuje do nich wniknąć ponownie, rozpoznają go. Jeżeli komórka ma mechanizm pozwalający pociąć DNA wirusa na kawałki, zanim dojdzie do jej genomu i się powieli, to go zniszczy. Nie pozwoli mu się, namnożyć.

Ten mechanizm zauważył Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna, za co dostały w tym roku Nagrodę Nobla z chemii.

Wielką zagadką zawsze było to, jak coś zmienić w jednym, ściśle określonym miejscu genomu – mówi dr Agnieszka Mierek-Adamska z Katedry Genetyki na Wydziale Nauk Biologicznych i Weterynaryjnych UMK. – W genomie człowieka mamy ponad trzy mld par zasad i to naprawdę nie jest proste, żeby trafić do konkretnego miejsca i po drodze nie zahaczyć o coś innego.

Dr Mierek-Adamska tłumaczy, że przed odkryciem metody "nożyc molekularnych" istniały i nadal istnieją inne techniki pozwalające dotrzeć do określonego miejsca w genomie, ale opierają się na bardziej skomplikowanych oddziaływaniach pomiędzy białkiem a DNA. Natomiast największą zaletą metody CRISPR jest to, że zachodzi oddziaływanie pomiędzy RNA i DNA. DNA jest zbudowane z czterech nukleotydów. Zasada Watsona–Cricka mówi, że adenina zawsze łączy się z tyminą (A–T), a guanina z cytozyna (G–C). - Tak samo jest w przypadku par DNA-RNA – wyjaśnia biolożka. – Wyobraźmy sobie najprostszą sytuację. W naszym DNA mamy sekwencję G-G-G-G. Jeśli w RNA stworzymy sekwencję C-C-C-C , to cząsteczki te się połączą. Bo pary Watsona-Cricka są ściśle określone.

Dr Mierek-Adamska dodaje, że jeśli mamy gen, znamy jego sekwencję tzn. układ nukleotydów i wiemy, że chcemy go zmodyfikować, to wystarczy wybrać miejsce i zaprojektować komplementarne RNA, czyli takie, które będzie pasować parami do DNA.

To jest jedyne, co musze zrobić, i zrobi to każdy student biologii, bo to nie jest nic skomplikowanego, w sensie tych par – wyjaśnia badaczka. - W przypadku  oddziaływania białko-DNA nie ma takiej prostoty. W białkach jest 20 różnych aminokwasów i uzyskanie białka skierowanego do określonego miejsca w DNA jest już bardziej skomplikowane.

Metoda CRISPR nie jest idealna, bo nasze nożyce molekularne niestety nie zawsze trafią tylko tam, gdzie byśmy chcieli. Są trzy mld par zasad w genomie, a naprowadzający RNA ma około 20 nukleotydów i jest prawdopodobne, że gdzieś indziej w genomie będzie pasująca kombinacja "czterech literek". W związku z tym, na obecnym etapie rozwoju nie jest to metoda, którą można bez obaw stosować u ludzi. Na razie naukowcy nie wiedzą jak nie dopuścić DO tzw. off targetów i mogliby wywołać skutki uboczne, nie planując tego.

Obecnie dzięki metodzie CRISPR naukowcy mogą tworzyć rośliny o zmodyfikowanym genomie, np. o zwiększonej odporności na pleśń, szkodniki i suszę.

Sekwencję genu, który chcemy zmienić, wrzuca się do przygotowanej bazy danych produkującej naprowadzające RNA.– Ja pracowałam na tzw. roślinie modelowej Arabidopsis thaliana, której genom jest znany – mówi dr Mierek-Adamska. – W takim przypadku analiza bioinformatyczna oprócz kilku różnych naprowadzaczy równocześnie określi nam off targety. Musimy się zdecydować, jeśli wydaje nam się, że to, co wyszło na komputerze, może działać, to zabieramy się do pracy.

Roślinę transgeniczną tworzy się w zależności od rodzaju rośliny, na której się pracuje różnymi metodami. W przypadku tej modelowej zwykle transformuje się ją poprzez zastosowanie tzw. metody bakteryjnej. Po pierwsze trzeba przygotować konstrukt genowy – naprowadzające DNA plus nukleazę, czyli enzym tnący, który "wprowadza się" się do bakterii.  Wykorzystuje się bakterie naturalnie występujące w środowisku, mające zdolność zakażania roślin. To są patogeny roślinne, które fragmenty swojego genomu wbudowują do genomu rośliny. Oczywiście trzeba je zmodyfikować, żeby nie wywoływały skutków chorobowych. Ten fragment genomu bakterii, który jest przez nie wprowadzany do genomu rośliny i warunkach naturalnych odpowiada za wywołanie symptomów choroby rośliny zostaje zastąpiony zaprojektowanym przez badaczy fragmentem DNA i to ten fragment zostaje wprowadzony do genomu rośliny przez bakterie i tak naprawdę one robią pracę za nich.

Fizycznie wygląda to tak, że naukowcy najpierw porażają agrobakterie prądem, co powoduje, że ściana bakterii staje się przepuszczalna i można jej zaaplikować sztucznie przygotowany wektor genowy. Później wybierają  wyhodowany np. Arabidopsis thaliana w określonym stadium rozwojowym, czyli takim, gdzie ma ładnie wykształcone kwiaty i albo te kwiaty moczą w zawiesinie z bakteriami, albo moczą pędzel w tej zawiesinie i malują kwiaty.

Wyhodowanie rośliny w całości zmienionej trwa do trzeciego pokolenia – tłumaczy dr Mierek-Adamska.

W tych badaniach chodzi o to, żeby uzyskać roślinę, która we wszystkich swoich komórkach będzie miała zmieniony genom. Ta roślina, na której pracowali naukowcy, nie będzie jeszcze zmodyfikowana, dopiero następna. – Wyhodowanie rośliny w całości zmienionej trwa do trzeciego pokolenia – tłumaczy dr Mierek-Adamska. – Dopiero wtedy linia jest stabilna, a całe potomstwo zawiera zmienione DNA. Potrzebujemy około sześciu-ośmiu tygodni na wyhodowanie jednego pokolenia Arabidopsis thaliana, więc łatwo policzyć, że przy wytężonej pracy po pięciu-sześciu miesiącach dochodzimy od konstruktu w probówce do stabilnej zmodyfikowanej rośliny.

Dr Mierek Adamska w swoich badaniach stosuję technikę CRISPR do badania białek metalotionein. Są to niewielkie białka występujące u wszystkich żywych organizmów zaangażowane w utrzymanie równowagi niezbędnych do życia mikroelementów takich jak cynk czy miedź oraz za usuwanie niebezpiecznych metali ciężkich jak kadm i ołów. U roślin jeden z rodzajów metalotionein jest zaangażowany w magazynowanie cynku w nasionach. Ma to ogromne znaczenie społeczno-gospodarcze, z jednej strony cynk jest niezbędny do prawidłowego i efektywnego kiełkowania nasion co przekłada się na wysokie i stabilne plony, a z drugiej nasiona są źródłem cynku w diecie człowieka zwłaszcza w krajach uboższych, gdzie spożywanie mięsa jest ograniczone. - Moje badania mają na celu wykazać czy metalotioneiny mają potencjał do zastosowania w biofortyfikacji nasion w cynk tj. uzyskanie odmian roślin o zwiększonej zawartości cynku co może przyczynić się do ograniczenia niedoboru tego pierwiastka zwłaszcza u dzieci w krajach o niskim i średnim dochodzie – tłumaczy biolożka.